黑寡妇是在2010年的《钢铁侠2》中初次登场，她的第一次登场就让人感觉十分震撼，姿势聪颖，身型性感迷人，相貌柔美，斯嘉丽约翰逊扮演的黑寡妇快速风靡全世界，变成世界最受重视的女漫威英雄。在《钢铁侠2》以后，斯嘉丽约翰逊的黑寡妇还相继在《复仇者联盟》系列1-4部、《美国队长》系列2-3部、《惊奇队长》末尾小彩蛋、《雷神3》末尾小彩蛋，共9部漫威英雄影片中亮相，但在其中沒有一部是彻底介绍其自身的影片，直到本片她才迈入了是自身的单独影片。
电影一开始， 1995年的俄亥俄州，年纪尚幼的叶莲娜Yelena（维奥莱特·麦格劳Violet McGraw 饰演）和11岁的娜塔莎Natasha（艾尔·安德森Ever Anderson 饰演）给绰号“红色守卫Red Guardian”的阿历克谢·肖斯塔科夫Alexei Shostakov（大卫·哈伯David Harbour 饰演）、“铁娘子Iron Maiden”梅琳娜·沃斯托克夫Melina Vostokoff（蕾切尔·薇兹Rachel Weisz 饰演）的潜入打掩护，伪装成美满的四口家庭。在家准备晚餐的过程中，电视里正播放着红极一时的动画节目《迪士尼午后》，正好轮到了《唐老鸭俱乐部》重播。
不料，由于阿历克谢Alexei从神盾局偷了一份绝密光盘，被神盾局发现；他回到家后，神色凝重地告诉家人，必须马上撤离。他们不得不逃回古巴的苏联基地，一家四口连夜踏上了逃亡的征程；娜塔莎在匆忙逃走的路上，抱着一本迪士尼公主的精装童话书，叶莲娜也拿着一个小马宝莉的玩具。
全家人到达一个农场，打开帆布，里面竟是一架飞机。母女三人率先登上了飞机。在阿历克谢的指挥下，梅琳娜Melina顺利启动了飞机，可再回头，神盾局的人马已经追了上来，还未登机的阿历克谢只能是一边追赶、一边用步枪反击……阿历克谢Alexei是注射超级血清、足以和美国队长相媲美的红色卫士，阻挡跑道的千斤重的挂车，他可以轻松掀飞……
不料，对面也驶来两辆警车；阿历克谢飞身趴在机翼上，用步枪精准射击对面警车的轮胎，使两辆警车相互碰撞翻车；混战中，一发流弹击中了梅琳娜；在飞机失控的瞬间，年幼的娜塔莎及时接过了飞机的控制权，眼看飞机就要与警车相撞，千钧一发之际，按照妈妈的指示，拼尽全力抬起操纵杆，控制飞机成功升空；看着外面脱险的父亲，娜塔莎露出了轻松的笑容……虽然逃亡的过程惊心动魄，但好在一家人还是有惊无险地躲过追捕，顺利飞回了古巴机场……
迎接他们的是特务头子德雷克夫Dreykov将军（雷·温斯顿Ray Winstone 饰演），受伤的梅琳娜被抬上了担架，阿历克谢则把获取的光盘交给了将军德雷科夫；而娜塔莎和叶莲娜则被丧心病狂的德雷科夫送进了人间炼狱般的“红房Red Room”，接受特工训练；而送入红房的这些女孩，有一个统一的代号——“黑寡妇Black Widow”；所以，娜塔莎的黑寡妇的名字并不是她一个人的。红屋成立于美苏冷战期间，是训练女间谍的特殊部门，负责人就是德雷克夫将军；无数女性孤儿被送进红屋进行非人训练，最终活下的不到5%，其余淘汰的都会被组织无情清理掉，即杀掉；每届学员，只有最厉害的那个黑寡妇特工才能毕业；而毕业典礼，竟是灭绝人性的做绝育手术。
其后，梅丽娜继续从事科研工作，阿历克谢之后由于特殊原因被"红屋Red Room"领导者德雷科夫关进监狱!
娜塔莎毕业时，年仅15岁，她也是从这个年龄开始进入了杀手界……
2010年，娜塔莎·诺曼诺夫Natasha Romanoff（斯嘉丽·约翰逊Scarlett Johansson 饰演）27岁，在一次执行任务时，娜塔莎被鹰眼巴顿完成了救赎，之后便决定弃暗投明，加入美国的神盾局。
影片闪回至布达佩斯任务，娜塔莎和鹰眼巴顿执行击杀任务，该任务正是能让她进入神盾局的最终招募任务，任务是要铲除培养了黑寡妇等人的俄罗斯残酷间谍机构红房子，干掉当时的主管德雷克夫Dreykov。然而为了达成这一目的，黑寡妇娜塔莎不得不残忍利用了德雷克夫的女儿安东妮雅Antonia（Ryan Kiera Armstrong 饰演）来确定他的行踪，让他放松警惕。最终，在一次德雷克夫和他女儿见面的过程中引爆了整座楼，引得匈牙利特种部队等势力追杀，躲躲藏藏10天才好不容易全身而退。
21年后，即2016年，复联内部以是否支持《索科维亚协议》而分为两派，娜塔莎站队钢铁侠一方，支持协议；但随着复联内战的爆发，作为复联英雄的娜塔莎因为控制住“黑豹Black Panther”T'Challa（查德维克·博斯曼Chadwick Boseman 饰演），放走了美队罗杰斯Rogers，致使她被联邦政府视为不支持协议的反派，从而遭受联邦政府罗斯Ross部长（威廉·赫特William Hurt 饰演）的通缉，钢铁侠对她也爱莫能助。
此时，罗斯Ross部长带领大队人马包围楼下（罗斯部长就是追捕绿巨人浩克的那个部长），殊不知娜塔莎早有准备，房间内仅仅是娜塔莎的跟踪器而已，娜塔莎本人早已独自藏进了挪威的深山老林。
镜头一转，挪威的深山老林，电台在播放新闻，显示出此时的历史背景，也就是介于《美国队长3：内战》和《复仇者联盟3：无限战争》之间；此时，娜塔莎眺向远处，挪威的森林中，是一处安全屋；持枪小心翼翼地摸了进来，当娜塔莎从镜中看到神盾局特工特工瑞克·梅森Rick Mason（O·T·法格本O.T. Fagbenle 饰演），露出了笑容，也放下枪；她俯下身看着鼾睡的瑞克，瑞克醒来，娜塔莎假装没好气地埋怨起来：“你睡在我床上？”瑞克起身，告诉娜塔莎护照、入境签证、当地驾照等事儿都办妥了；说着，瑞克给了她几个不同的驾照、护照等物品，手背在背后，说：“混合搭配后，20个身份够你用一阵子了吧。”。娜塔莎吐槽了其中一个名字芬尼·隆巴顿（Fanny Longbottom），觉得这个名字很小女孩。【而在片尾彩蛋中，叶莲娜养的最后那只狗就叫做芬尼，并且确实有一个毛茸茸的长尾巴（Longbottom）】
而与此同时，娜塔莎的妹妹叶莲娜·贝洛娃Yelena Belova（弗洛伦丝·皮尤Florence Pugh 饰演）依旧是黑寡妇组织的成员，这次的任务是在莫斯科干掉华裔女人奥克珊娜Oksana（米歇尔·李Michelle Lee 饰演），抢走她手里的箱子……一番缠斗之后，叶莲娜Yelena一刀捅进奥克珊娜Oksana的肚子，奥克珊娜Oksana直接瘫软躺在地上；可奥克珊娜Oksana却在临死前放出了一管红色合成气体（化学征服剂的中和剂），叶莲娜Yelena的瞳孔泛起红光，接着便摆脱了总部的精神控制，恢复了自我意识。奥克珊娜Oksana将箱子交给了叶莲娜Yelena，嘱托她救出其他黑寡妇成员。为了拯救更多的同伴，叶莲娜Yelena强忍剧痛，用匕首挖出了大腿里的追踪器，切断与总部的联系；随后，她便带着剩余的药剂迅速展开了逃亡。
之后，叶莲娜Yelena躲藏匈牙利的布达佩斯，将药剂寄给了特工瑞克·梅森Rick Mason，由瑞克转交给她认识的唯一一个超级英雄——复仇者联盟成员，就是姐姐娜塔莎/黑寡妇。
不久后，隐居山林的娜塔莎收到了一个神秘包裹，因之前特工瑞克提到过，她以为是杜兰特寄来的，便没有在意，随手就把箱子丢在了车上。之后，黑寡妇娜塔莎在拖车中喝着啤酒，看起了《007 之太空城》，似乎已经对其中的内容熟读于心。实际上《007 之太空城》和本次剧情也很呼应，失窃的太空船对应了一直难以定位的“红房Red Room”，有害的神经毒气对应了可以解除寡妇们控制解毒气体。
晚上，娜塔莎房间突然停电，原来是发电机没柴油了。于是，娜塔莎开车去镇上给发电机买油……可车子刚开到桥上，一支飞箭射到车的底盘下，箭头的炸弹随即爆炸，汽车直接被炸飞了几十米开外，最终悬在了桥边。紧接着，一个身影下车，缓缓走向了娜塔莎，——她身穿铠甲，头戴头盔，她就是雷德科夫的终极杀手武器“模仿大师Taskmaster”（欧嘉·柯瑞兰寇Olga Kurylenko 饰演）。顾不上掉落的汽车，娜塔莎抬起手枪疯狂射击，但没想到对方的盾牌居然是美队同款；对方用盾牌遮挡子弹，再学美队一个飞盾砸向娜塔莎，娜塔莎只得躲闪；对方趁机飞身上前，和娜塔莎展开搏斗；此人不仅武艺高强，还由铠甲护体，头盔也能像钢铁侠的头盔一样能分析对手的攻击套路和弱点！眼看装备上占不到便宜，娜塔莎也只好更换战术，飞扑上前送出夺命剪刀脚。然而，对方竟使出了同样的招数，就连起身的动作都能完美模仿复制。
正当娜塔莎犯懵的时候，模仿大师却回头扫描了身后的箱子；娜塔莎这才得知箱子里的东西才是她的目标关键，她果断利用绳索将模仿大师吊在了半空。可刚摸到箱子，身后的模仿大师便斩断绳索，一路火花地飞到了面前。娜塔莎捡起了盾牌，顽强抵抗，不料却被一脚踹到桥下河里。随后，模仿大师打开了箱子，可里面的东西早已被娜塔莎拿走了。
死里逃生的娜塔莎从河里爬上岸，掏出了口袋里的东西，发现是一捆红色药剂试管和一张自己与妹妹的合影照片，这才明白是妹妹叶琳娜寄给她的。
为了搞清这种合成气体到底是什么?娜塔莎根据上面的地址，来到了布达佩斯的安全屋；在这里，她碰到了妹妹叶莲娜。但同为特工的两人多年未见，不知对方是敌是友，刚一见面，便上演了一场精彩绝伦的寡妇对决。打斗过程中，娜塔莎一把扯下窗帘，两人同时缠住了对方，就在都快被勒死的时候，娜塔莎提前松开了手，叶莲娜见状也随即停止了战斗。
随后，叶莲娜告诉娜塔莎，寄给他的药剂可以拯救所有被控制的黑寡妇，自己也是因此摆脱了德雷科夫的精神控制。原来，这种合成气体是一种思维控制解药，可以使"红屋"里的寡妇军团摆脱德雷科夫对他们的控制！
姐妹俩谈话中，娜塔莎获知“红房Red Room”并没有真正消失，之前用炸弹未灭掉头目德雷科夫，对害了他无辜的女儿安东妮雅而心有愧疚……
其后，叶莲娜在小卖部吐槽黑寡妇娜塔莎的经典姿势，趴在地上头发甩来甩去，问她是不是特意如此设计的……二人回到家，正闲聊着，房顶突然被炸开，寡妇杀手们再次追了上来；惊险地避开了子弹，两人一路从窗户逃到了屋顶。眼看前方已无路可逃，姐妹俩拆掉金属桶烟囱连接墙体的支架，抱住金属桶烟囱，打算荡到对面。这时，一个黑女寡妇Lerato（利亚尼·塞缪尔Liani Samuel 饰演）却纵身扑来，但她没能抱住金属桶烟囱，就在即将坠落的那一刹那，娜塔莎手疾眼快地拉住了她，可她却拔出匕首；无奈，娜塔莎松手，黑女Lerato坠落地面……
娜塔莎来到楼下，看到那个黑女Lerato躺在雨水中，本想上前救她，但还没等靠近她，远在总部的德雷科夫便远程操控、启动自杀程序，使她不由自主地自行了结了，——原来，如今的黑寡妇体内都植有控制芯片，不仅能跟踪监视她们，还能远程操控她们。看着惨死的黑妹，娜塔莎暗自发誓，一定要端掉“红房Red Room”，救出所有被控制的黑寡妇.....
而后，二人先骑摩托，再换轿车，在布达佩斯街头展开飙车追逐……甩掉所有黑寡妇杀手后，二人又遇到驾驶装甲车的模仿大师；只见模仿大师拉弓射箭，如同鹰眼巴顿附体，一箭射在车的底盘，箭头炸弹爆炸，直接将车炸翻！所幸二人的车底朝天从一个个车顶滑过，又顺着台阶滑进地下的地铁站；二人从车里钻出，迅速躲进一个秘密房间，总算躲过了追捕……娜塔莎从叶莲娜口中得知，那个身穿铠甲的神秘人是德雷科夫的得力干将“模仿大师”，她能模仿所有人的经典动作，比如娜塔莎的剪刀腿、蜘蛛侠的后空翻；除了招数，她还能复制所有的武器和铠甲，比如美队的盾牌、黑豹的振金爪、鹰眼巴顿的弓箭以及钢铁侠头盔的智能系统；模仿大师的学习方式很简单，就是短视频录制学习，如录制《钢铁侠2》中的娜塔莎大战保安、《美国队长3》中的鹰眼单挑黑豹……
为了彻底摧毁"红屋Red Room"，姐妹俩驾驶特工瑞克提供的直升机，前往俄罗斯冰雪覆盖的古拉格监狱，解救二人的养父"红色守卫"阿历克谢。
此时，“红色守卫”阿历克谢Alexei在监狱被关押已长达20年，他时常吹嘘自己和美国队长的交战史。这天，阿历克谢吹嘘时，一个名叫Ursa Major（奥利维尔·里希特斯Olivier Richters 饰演）的魁梧角色向他发起掰手腕挑战；最后，他因为不断挑衅红色守卫而被掰到手断，并被笑称为哭嘤嘤的大熊。
娜塔莎通过信件，给阿历克谢送去了微型的无线电对讲机，准备里应外合进行劫狱……不料，阿历克谢却直接蛮干，一脚踹开铁门，再飞奔向监狱大墙；纵身飞越时，由于他身体过于臃肿，只飞到墙的半腰，攀爬上去，直接被狱警用电击棍电倒地面……
此时，娜塔莎和妹妹叶琳娜驾驶直升机飞来；娜塔莎腰挂升降索，飞身坠落监狱内的钢架通道桥，强力支援阿历克谢，与狱警展开大战……监狱一个塔楼内的狱警持机枪朝直升机扫射，叶琳娜直接用火箭弹一炮轰掉塔楼……但是，爆炸声引发旁边雪山上的积雪产生雪崩，冰雪如同巨浪滔天朝监狱袭来，监狱内一时大乱，纷纷躲避逃亡……趁着大乱，叶琳娜驾驶直升机悬挂着娜塔莎，由娜塔莎抓住阿历克谢的手，将阿历克谢救出监狱……
然而，连阿历克谢也不知道目前"红屋Red Room"的具体位置。为了找到"红屋"，他们三人又一同前往圣彼得堡，寻找"铁娘子"梅丽娜!
三人来到圣彼得堡郊外的一个小院，找到梅丽娜。自从儿时分开后，时隔二十多年，一家四口人又再次相聚，重温了家庭的温暖；阿历克谢还特意穿上那件20年没洗的红色战衣，由于身体发福臃肿，套了半天才套上战衣；还色迷迷、兴致勃勃地对梅丽娜说：“我刚从监狱里出来，现在正精力充沛”……
接着，梅丽娜讲出了当初阿历克谢偷出光盘的事。原来，光盘里的情报就是如何使用超级血清进行“冬兵计划”的内容，德雷科夫在此基础上发明了洗脑技术；如今，德雷科夫的红屋已做大做强，他控制的杀手已遍布全球；进而德雷科夫的野心也不断增长，他已不满足做间谍情报，如今他想称霸全球。德雷科夫能有今天的成就，全靠阿历克谢和梅丽娜的参与。
当得知妈妈就是整个事件的参与者，姐妹俩十分伤心。由于娜塔莎从红屋毕业的早，所以没有被洗脑；叶琳娜则不清楚是否被洗脑，她问母亲梅丽娜，梅丽娜却沉默不语。叶琳娜悲伤地站起身离开餐桌，独自回卧室。虽然梅丽娜嘴上说对这个家庭没有感情，但娜塔莎发现屋里书架上还保留着当初一家人的相册。经过娜塔莎的苦口婆心劝解，梅丽娜终于同意摧毁红屋。但是，梅丽娜早已将三人来到此处的消息通知给了模仿大师；因此，如今二人只能将计就计了。
很快，模仿大师率领车队赶到，阿历克谢站在门口，顿时被麻醉飞镖射成刺猬……叶琳娜准备战斗，却发现娜塔莎已晕倒；再一转身，直接被母亲梅丽娜用电击棍电晕！就这样，三人被模仿大师生擒活捉……
模仿大师驾驶飞机，直接飞到空中悬浮堡垒——原来，红房Red Room是位于天空中的悬浮堡垒！难怪这么多年，娜塔莎和阿历克谢等人一直找不到红屋的所在地！
娜塔莎和阿历克谢被送进玻璃房间囚禁，叶琳娜则被送进实验室、接受重新洗脑，而梅丽娜则去面见德雷科夫。
不料，梅丽娜刚来到德雷科夫面前，德雷科夫就揭下她的面罩，——原来，她是娜塔莎易容改变的，娜塔莎和梅丽娜互换身份！
另一边玻璃房内，“娜塔莎”揭下面罩，露出梅丽娜容颜，阿历克谢这才恍然大悟！梅丽娜通过微型对讲机，告知耳朵里有耳麦的叶琳娜：你身上暗藏有武器！于是，叶琳娜从手术床上翻身坐起，掏出匕首砍杀旁边的医护人员……梅丽娜告诉叶琳娜，按照计划，让她去找解药、解救所有杀手；而梅丽娜自己，则负责黑进红屋操控系统，启动降落程序，使空中基地降落地面……阿历克谢问他干什么，梅丽娜说你负责保护我……
这边，娜塔莎在控制中心设法稳住德雷科夫，而德雷科夫则让模仿大师摘下头盔，——原来，模仿大师就是他女儿安东妮雅Antonia（欧嘉·柯瑞兰寇Olga Kurylenko 饰演）。安东妮雅在当初并未被炸死，只是被毁容了；其后，她的后脑被亲生父亲德雷科夫植入了芯片，拥有了超强的学习模仿能力，成为了她父亲的工具杀手……
而后，德雷科夫让女儿去对付梅丽娜，他则留下对付娜塔莎……模仿大师来到玻璃房，阿历克谢与其展开肉搏，奈何安东妮雅战斗力爆表……
梅丽娜侵入红房系统，发现德雷科夫早有准备，系统被一键锁屏；无奈，梅丽娜只得实施B计划，直接开枪毁掉基地的一个引擎！此招立竿见影，基地马上开始崩塌坠毁……
叶琳娜赶到玻璃房，与父亲阿历克谢合力将模仿大师锁进玻璃房内……而后，叶琳娜去解救其他黑寡妇；阿历克谢则和梅丽娜去找逃生的飞机……
这边，娜塔莎遇到大麻烦，——原来，老奸巨猾的德雷科夫已研制出一种气体神经毒剂，只要一闻，大脑就立即会制止躯体对德雷科夫进行任何伤害。德雷科夫对娜塔莎就是一顿掌掴辱骂，随后，德雷科夫开始犯下所有好莱坞大Boss一贯风格的错误，——死于话多！德雷科夫在娜塔莎面前得意地展示自己的野心计划，他凭借分布全球的特工，可以控制石油、股价、乃至一个国家政权，基地系统的操控必须由他手指上的戒指来解锁完成！
娜塔莎得知系统的解锁秘密后，一头砸向桌面，磕破自己的鼻子，以鼻子的痛觉掩盖鼻子对神经毒剂的嗅觉，切断毒剂对神经的控制；娜塔莎一拳干翻德雷科夫，抢走他手指上的戒指；当娜塔莎拔出武士刀要砍杀德雷科夫时，一群黑寡妇杀来，娜塔莎只得孤身应付一群杀手，德雷科夫趁机溜走……一拳难敌四手，娜塔莎很快被一群黑寡妇制服！危机之时，拿到解药的叶琳娜赶来，将解药合成气体喷洒出，所有黑寡妇立刻清醒过来，停止攻击……
此时，基地即将坠毁。娜塔莎让叶琳娜带着众多黑寡妇前行撤离，她留下下载特工名单数据，以解救全球的特工……下载完数据，娜塔莎拿走硬盘；烈火已喷涌至前，娜塔莎捡起地上两支解药试管，纵身一跃跳出窗外；再沿外墙往下攀，她看到了困在玻璃房内的模仿大师安东妮雅；由于内心的愧疚，娜塔莎就过去解救她。突然，一声爆炸，将两人炸开……
另一边，德雷科夫正带着卫队登上直升机上，准备起飞时，叶琳娜追来，她纵身一跃，扒在机身上，再将炸弹塞进螺旋桨内，只见一声爆炸，德雷科夫随着破碎的直升机灰飞烟灭了……
就在叶琳娜坠落时，娜塔莎拿着一个降落伞一跃而下，在空中滑行一段时间后，终于抓住叶琳娜，将降落伞背包穿在她身上、打开降落伞，二人终于安全了；这时，模仿大师又高速滑翔过来，娜塔莎只得松开身穿降落伞的叶琳娜，自己与模仿大师扭打在一起……扭打过程中，再撑开自己身上的降落伞，二人安全着陆；模仿大师又抽出刀攻击，娜塔莎瞅准时机，按下她身上的控制键，弹下她的头盔，再一拳砸碎试管解药，红雾弥漫，安东妮雅顿时清醒，停止攻击……
阿历克谢、梅丽娜和叶琳娜走来，一家四口又团聚了；这时，其他黑寡妇也乘直升机飞来。不料，罗斯将军带着车队杀来，阿历克谢表示一起战斗解决掉他们，但娜塔莎说她自己的事由她自己解决，让阿历克谢带着她们驾驶直升机离开，自己留下任由罗斯将军逮捕带走；临走时，叶莲娜也把自己心爱的多口袋黑马甲给了寡姐娜塔莎……
镜头一转，娜塔莎Natasha逃了出来，发型成了黄色短发，身穿多口袋黑马甲（这也是寡姐在《复联3》出现时一直穿的那件）；特工瑞克为她提供了一架昆式战机；娜塔莎驾驶战机起飞，前往海上基地解救其他特工（或许说明她此时已经联系上了美国队长，然后和美国队长一起去木筏监狱帮猎鹰他们越狱，这也是《美队3》中的片尾结局）……
影片的最后有个彩蛋，就是在复联4结束后，妹妹伊莲娜Yelena来到姐姐娜塔莎的衣冠冢前祭拜；这时，女伯爵瓦伦蒂娜Valentina（Julia Louis-Dreyfus 饰演）走过来，谎称找到那个让她姐姐丧命的人了；叶莲娜拿过平板说到血债血偿，而上面是鹰眼（克林特·巴顿）的照片！从彩蛋里可以分析到，叶莲娜和鹰眼到时会有一次不打不相识，但互相杀个你死我活我觉得倒不至于，等叶莲娜到时知道真相，肯定不会去想要干掉鹰眼。
